途：

    本試劑盒采用ELISA法可定性、定量檢測(cè)P24抗原，適用于血清、血漿及HIV培養(yǎng)上清標(biāo)本，僅限于HIV輔助診斷和實(shí)驗(yàn)室研究。

測(cè)定原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心法測(cè)P24抗原，即將抗P24的單克隆抗體包被于微孔板，待測(cè)樣本加入已包被的反應(yīng)孔內(nèi)孵育，若標(biāo)本中含有HIV-1p24抗原，則該抗原與孔內(nèi)的抗體形成抗原抗體復(fù)合物，加入酶標(biāo)抗HIV-1p24單抗，孵育后，酶標(biāo)抗體與抗原抗體復(fù)合物上的抗原結(jié)合，再與底物反應(yīng)顯色。最后用硫酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，確定反應(yīng)的陰陽(yáng)性。

試劑盒組成：

1、微孔反應(yīng)板         8孔×12         3、陰性對(duì)照  6ml           5、酶結(jié)合物             13 ml            7、顯色劑   7ml         9、終止液   6ml

2、裂解液             3.5ml           4、陽(yáng)性對(duì)照  1ml           6、20倍濃縮洗滌液    50ml          8、底物液   7ml                        

測(cè)定步驟：

1、配液：將50 ml濃縮洗滌液（20倍）用蒸餾水稀釋至1000 ml。

2、定量P24系列稀釋：陽(yáng)性對(duì)照（PC）含有320pg/ml的重組P24抗原，用陰性對(duì)照(NC)倍比系列稀釋五個(gè)濃度的陽(yáng)性對(duì)照（稀釋方法見(jiàn)下表），如果定量測(cè)定的樣品為細(xì)胞培養(yǎng)上清液，則需用未感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行系列稀釋抗原，每個(gè)稀釋濃度做兩個(gè)復(fù)孔。

表1

3、編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照3孔、陽(yáng)性對(duì)照兩孔、空白 1孔，如果測(cè)定樣品為細(xì)胞培養(yǎng)上清液 ，則需用未感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液做陰性對(duì)照3孔。

4、每個(gè)反應(yīng)孔中加入25μl裂解液。

5、將100μl待測(cè)樣品或?qū)φ掌芳尤氲接辛呀庖旱姆磻?yīng)孔中，振蕩30-60秒混勻，置37℃孵育1小時(shí)。

6、洗板5次，拍干后每孔加入酶結(jié)合物125μl/孔（空白孔不加），置37℃孵育45分鐘。

7、洗板5次，拍干后每孔加入底物（底物液：顯色液=1：1混合）125μl/孔。置37℃孵育15—30分鐘。

8、加入終止液50μl/孔。

9、用酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長(zhǎng)450nm(建議使用雙波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，參考波長(zhǎng)630nm)。

結(jié)果判定：

1、陰性對(duì)照的正常范圍：正常情況下，陰性對(duì)照OD值應(yīng)≤0.150。

2、陽(yáng)性對(duì)照的正常范圍：正常情況下定性測(cè)定(160pg/ml) 陽(yáng)性對(duì)照OD值≥1.000；定量測(cè)定80 pg/ml陽(yáng)性對(duì)照OD值≥0.650

3、臨界值計(jì)算：測(cè)定樣品為血清或血漿時(shí)臨界值=陰性對(duì)照平均值+0.071；測(cè)定樣品為細(xì)胞培養(yǎng)上清液則臨界值=細(xì)胞培養(yǎng)上清液陰性對(duì)照平均值+0.071

4、陽(yáng)性定性判定：測(cè)試標(biāo)本的OD值小于臨界值則為陰性；測(cè)試標(biāo)本的OD值大于或等于臨界值則為陽(yáng)性。

5、陽(yáng)性定量判定：參照如下圖表的方法，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行定量判定。

表2

NC1=0.033   NC2=0.032  NC3=0.034  NCx=0.033

Cut  off=0.033+0.071=0.103                                                                               

注意事項(xiàng)：

1、從冷藏環(huán)境取出的試劑盒內(nèi)全部成份及待測(cè)標(biāo)本應(yīng)在室溫平衡30分鐘后方可使用，余者應(yīng)及時(shí)密封保存于冰箱中，已備后用（一般不超過(guò)3天）。

2、洗滌液若出現(xiàn)結(jié)晶，可置37℃使之溶解后方可使用。

3、結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，建議使用雙波長(zhǎng)450nm/630nm檢測(cè)，并在反應(yīng)終止后20分鐘內(nèi)完成。

4、本試劑的使用單位必須是經(jīng)當(dāng)?shù)匦l(wèi)生行政部門(mén)批準(zhǔn)的HIV初篩實(shí)驗(yàn)室 。

5、檢測(cè)必須符合HIV實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范和生物安全守則的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染。操作時(shí)須帶手套、穿工作服，嚴(yán)格健全和執(zhí)行消毒隔離制度。所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染務(wù)處理，終止液為2M的硫酸，使用時(shí)必須注意安全。

6、加液時(shí)必須用加液器，并經(jīng)常校對(duì)加液器的準(zhǔn)確性。

7、洗滌時(shí) 各孔均需加滿洗液，防止孔口內(nèi)有游離酶存在。使用洗板機(jī)洗滌應(yīng)設(shè)定30-60秒的浸泡時(shí)間。

8、操作應(yīng)嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，不同批次試劑不得混用，封板膜為一次性用品，不能重復(fù)使用。

儲(chǔ)存條件：2-8℃避光保存。   有效期：12個(gè)月。